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论坛精文|卵胞浆内单精子注射用高DNA完整性人单精子的定量选择
每周五，捕精论坛与您如约相见！本周分享一篇名为《卵胞浆内单精子注射用高DNA完整性人单精子的定量选择》的研究。
介绍
在单细胞水平上研究精子的运动和形态参数是否反映了其DNA的完整性，并建立一套选择DNA完整性高的单个精子的定量标准。
胚胎学家对精子的定性和经验性选择固有的主观性和不一致性。减少主观性要求用自动定量选择代替手动定性选择。世卫组织规定了一些精子能动性和形态参数(如直线速度[VSL] R 25 mm/s)的定量评估标准.因此，对于运动性和形态学的许多参数，世卫组织仅定义了定性标准(例如，精子头部应具有规则的轮廓)，无法定量实施。
本次分享的目的是建立和评估一套选择具有高DNA完整性的单个精子的定量标准。为了确定标准，我们首先检验并确认了长期假设的假设，即在单细胞水平上，运动性和形态正常的精子DNA片段化程度较低。在世卫组织精液检查标准的基础上，建立了一套定量标准。为了定量应用既定标准，我们开发了计算机视觉算法来测量活精子的运动性和形态参数。这些算法与定量标准一起被整合到一个软件程序中，该程序可在临床ICSI中进行无创和定量精子选择。
方法
01研究设计
选择了5名患者和每名患者15至20个精子的样本量，用于胚胎学家进行精子选择的实验。样本量为440个精子，用于检测采用的世卫组织定量标准的有效性。
02精子运动和形态参数的测定
使用定制开发的计算机视觉算法将一台摄像机连接到一台标准倒置显微镜上，以便以每秒30帧的速度捕获活精子的图像。在40倍放大倍率下，在成像仪中采集图像。精子参数的测量始于在同一显微镜视野内跟踪多个精子，以提取每个精子的轨迹。基于自适应联合概率数据关联滤波的跟踪算法能够在精子交叉过程中区分多个精子。在跟踪过程中，在每个精子周围设置一个感兴趣区域。然后应用图像分割提取精子头部、中段和尾部的轮廓，用于形态学测量。
03单个精子中DNA断裂的测量
测量精子的能动性和形态参数后，将精子转移，通过彗星试验进行DNA片段化测量。
04检测片段化DNA片段中基因的存在
在彗星试验中，碎片DNA片段在电泳过程中迁移，形成彗星尾。完整的DNA不会迁移，它会形成彗星头。通过使用两个玻璃微移液器进行显微操作，将含有碎片DNA片段的彗星凝胶(即彗星尾)与凝胶基质物理分离。然后，将含有片段化DNA片段的提取彗星凝胶收集在试管中，裂解并转移用于聚合酶链式反应(PCR)。切取检测条带进行基因测序。将测序结果与目标模板序列进行比较，以确认PCR产物的特异性。
05统计分析
结果用平均值的平均标准误差表示。统计分析是使用MedCalc 18.3软件进行的。
结论
按照世卫组织定性标准选择的单个精子的DNA片段化程度低于精子群体
根据世卫组织的说法，正常的运动意味着快速和进步的运动(图. 1a)，正常形态要求精子头部、中段或尾部无缺陷(图. 1b至d)。从病人身上采集的同一样本中，3名胚胎学家(均具有> 5年经验)按照世卫组织定性标准选择15至20个精子运动正常，形态正常。
每个胚胎学家都有相同的时间(15秒)来选择每个精子。对五份患者样本重复进行数据收集。转移每只选定的精子，通过单细胞凝胶电泳(彗星试验)进行DNA片段化测量。使用彗星试验是因为它能够量化单个精子内DNA断裂的程度或程度，而其它测定法或者测量群体中DNA片段化精子的百分比(例如，精子染色质结构测定法) 或仅给出关于精子DNA是否片段化的是/否结果(例如，精子染色质分散、末端脱氧核苷酸转移酶[TdT]-介导的dUTP缺口末端标记和吖啶橙染色)在彗星试验中，DNA片段在电泳过程中迁移，形成彗星尾，完整的DNA保留在彗星头中。彗星尾巴时刻来测定DNA的断裂水平。与样本群体(即生精液)相比，定性选择的正常精子具有显著较低的DNA断裂(4.47±0.38 vs 8.29±0.58，P < .001图. 1e)。所选精子的平均DNA片段化水平比样本群体低46.1%。这一结果提供了第一个直接的证据证明单个精子正常的运动性和形态符合世卫组织的质量规定的标准具有低的DNA断裂。毫不奇怪，手动定性判断精子能动性和形态是主观和不一致的。不同胚胎学家从同一患者样本中选择的精子具有不同的DNA片段化值。与定性选择相比，我们预期定量选择可降低主观性，进一步减少DNA片段化。
图1
精液检查世卫组织定量标准的适应性
世卫组织运动性标准定义为VSL >25 mm/s(图.2a)。我们研究了PVP对精子速度的影响，以标度25 mm/s的速度阈值。将同一个体精子从生精液依次转移到添加7% PVP的标准ICSI培养基中，并测量精子在2种培养基中的速度变化。为了将转移过程中切应力对精子能动性的影响降至最低，我们使用了大内径的微量移液器(30-um，而不是5-um ICSI微量移液器)。精子沉积到ICSI培养基中后，在精子离开沉积位置后进行速度测量，以避免因培养基转移而产生潜在的培养基改变效应。
几乎平行的线条图2b显示单个精子速度下降幅度几乎相等，不同样本间差异无统计学意义(ANOVA P > 05)。通过最小二乘线性拟合得到两种速度之间的关系(图2c)。通过将原始速度阈值(25 mm/s)代入拟合直线，将在ICSI培养基中选择正常精子的速度阈值(即适应的能动性标准)设定为13.5 mm/s。
对于形态学评估，定义了染色和固定精子而不是活精子的世卫组织标准(图. 2a和d).在染色和固定过程中，精子的头部等结构收缩(29)，使得世卫组织标准不适用于ICSI中的活精子选择。因为收缩主要是各向同性的(30)，头部长宽比标准在我们的定量标准中保持不变。对于二元(是/否)标准，为了建立一套可定量实施的标准，我们进一步量化了每一个形态学标准，并定义了判断常态的阈值。
图2
单个精子活力和形态的定量测定
为了定量应用这些标准，我们开发了一个精子选择软件程序，该程序集成了已建立的定量标准和用于测量精子能动性和形态参数的计算机视觉算法。该软件首先通过安装在显微镜上的摄像机捕获活精子视频，然后应用算法自动测量精子参数。
为了检验既定的定量标准，我们从17例接受ICSI治疗的患者中收集了含有440个随机选择的精子。
测量了每只精子的能动性、形态和DNA片段化。我们的精子选择软件选择了60个正常精子；即60个精子的每个运动性和形态参数都满足标准；
而其它380个精子具有至少一个异常(一个或多个参数不满足标准)。所选的60个正常精子的DNA断裂程度显著低于未选的异常精子(3.55±0.58对7.87±0.51，p < 0.001；图3a)。此外，应用经调整的定量标准显著降低了。
单精子(3.55±0.58，左栏中图 3a)与根据世卫组织定性标准(4.47±0.38，左栏中)选择的单个精子相比图1e)。
图3
DNA断裂是导致运动和形态异常的潜在原因
为了进一步了解为什么运动性和形态参数与DNA片段化之间存在相关性，我们假设含有运动性和形态调节基因的DNA片段的片段化会导致精子运动性和形态异常。相反，选择运动性和形态正常的精子可以降低选择DNA片段化精子的可能性。我们通过检测碎片DNA片段中运动性和形态调节基因的存在来检验这一假设。我们选择了200例能动性和/或形态异常的精子，并对这些精子作为一个群体进行了彗星试验。彗星试验后，将彗星尾(即碎片DNA)与彗星头物理分离，并提取用于PCR。彗星尾部的提取是保守的，并且非常小心，以确保彗星头部没有被提取(图4a和b).我们检测了调节人类精子能动性和形态的六个候选基因(CATSPER1、CFAP43、DNAH1、SLC26A8、AURKC和SPATA16)。
通过PCR和凝胶电泳在提取的彗星尾中检测到2个基因(CFAP43和SLC26A8)图 4b)。检测到两条SLC26A8条带，上条带可能是因为PCR中的非特异性反应。为了确认检测基因的特异性，随后对两条条带(用中的红色ar-row标记)进行基因测序图4b)。结果表明，运动和形态调节基因的片段化是精子运动和形态异常的潜在原因。
图4
讨论
基于精子能动性和形态参数的定量测量，我们的单精子选择方法是非侵入性的。与其他精子分析方法(如计算机辅助精子分析)不同，后者可额外测量精子的能动性和形态，我们的方法在没有侵入性染色的情况下测量相同活精子的参数，可直接应用于ICSI。与使用根据能动性对精子进行分类的微流体装置的精子选择不同，我们的方法同时考虑了精子能动性和形态。如我们的结果所示，选择高DNA完整性精子需要正常的运动性和形态。与使用拉曼显微分光镜检查的其他非侵入性精子选择技术不同或数字全息术为了评估精子DNA的完整性，我们的精子选择方法不需要对临床ICSI设置中的成像系统进行修改，并且可以与临床ICSI无缝集成。
我们采用了世界卫生组织最初用于精液分析的标准，并建立了一套卵胞浆内单精子注射单精子选择的定量标准。符合标准的精子DNA片段化水平显著低于样本群体。精子需要正常的能动性和正常的形态才能具有低DNA断裂。将定量标准整合到精子选择软件程序中。在我们的软件和三名胚胎学家从同一患者样本中选择精子的盲法测试中，我们的软件优于胚胎学家，并选择了DNA完整性最高的精子。
在单细胞水平上，精子的运动和形态参数反映了其DNA的完整性。所开发的技术和标准有可能减轻卵胞浆内单精子注射中精子DNA片段化的风险因素。