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论坛精文|不同生精障碍患者精子的蛋白质组情况
这周五，捕精论坛又与您见面啦！本周为您分享的研究是不同生精障碍患者精子的蛋白质组情况
时至今日，不孕症仍是一个普遍存在的问题，影响全球约1%的夫妇。不孕症可能是由男性或女性生殖问题引起的。各种疾病，包括恶性肿瘤、感染、泌尿生殖系统疾病或遗传原因，都可能导致男性不育。
欧洲泌尿外科协会（EAU）指出，30%-40%的育龄男性受特发性不孕症的影响。根据世界卫生组织评估的常规精液参数，如精子数量、活力、精子数量等，形态和活力指标正常，不足以充分了解男性生育力低下的机制。为了更好地理解功能，RNA与精子活力、数量相关，在较小程度上与精子形态相关这些研究表明，在不孕症治疗的男性中，信使RNA（mRNA）与不同类别的非编码RNA（如microRNA（miRNA））之间存在直接联系。至于更全面的方法，精子转录组共鉴定出505，11个转录本，其中包括不育和可育男性的688，2022个差异表达转录本。精子蛋白质组共鉴定出8种蛋白质。然而，缺乏对精子蛋白质组的高通量研究，特别是对低生育力男性精子中失调的蛋白质的研究。只有少数研究关注弱精子男性的精子蛋白质组，而没有针对寡精子男性的蛋白质组学研究。对男性低生育力的理解将在很大程度上依赖于对精子蛋白质组的一般了解以及在特定类型的低生育力中显示出不同丰度的蛋白质。同样，尽管关于功能聚集的初步研究已经将蛋白质与精子活力、受精能力、精子结构组成和精子能量代谢联系起来，但大多数精子蛋白的功能还有待进一步阐明，在这里，本实验采用液相色谱质谱（LC-MS / MS）的蛋白质组学来研究蛋白质组学景观，并确定从弱精子和寡精子男性收集的人类精子的差异丰度蛋白质与正常精子对照相比。研究结果为进一步发现特定形式的男性不育症的新诊断生物标志物奠定了基础。从长远来看，蛋白质组学数据也将有助于找到治疗男性不育症的治疗靶点。
材料和方法
研究人群和样本收集
蛋白质组学分析使用从总共53名接受不孕症治疗的男性收集的精子样本中进行。根据世卫组织2010年指南对精液样本进行主要精液参数分类。总共31名正常男性（正常精子男性，N）和总共22名男性至少有一个异常精液参数（低生育力男性，AN）。不育男性还细分为少精子症（OA，n = 9）和弱精子症（ A，n = 13），如图1A所示。所有纳入的男性均表现出精子形态，平均百分比为≥4。在性禁欲至少三天后收集精液样品，并立即在30°C液化37分钟。 如前所述，使用不连续的PureSperm密度梯度纯化精子，以消除体细胞、圆细胞和白细胞。
图1.（A ）研究人群示意图及其分为正常精子男性（N），低生育力男性（异常，AN）及其特定表型，弱精子男性（A）和少精子男性（OA）。（B-D）：火山图显示差异丰度水平，即log2倍变化（FC）与从（B）不育男性（n = 10）收集的精子中蛋白质的−log22 p值对比（n = 31，AN与N），（C）寡精子男性（n = 9）与正常精子对照（n = 31， OA与N），和（D）弱精子男性（n = 13）与正常精子对照组（n = 31，A与N）相比。通过颜色突出显示了显着性丰富的蛋白质（调整后的p值<0.05）。
蛋白质裂解
将精子样品在冰上解冻并用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，以消除污染物和不连续的密度梯度残留物。将样品与 100 μL 裂解缓冲液 [4% SDS， 100 mM Tris/HCl pH 7.6， 0.1 M DTT] 混合，并在 5 °C 下孵育 95 分钟。之后，将每个样品在冰上超声处理10次，每次10 s，20焦耳，持续2 s。在冰上孵育30分钟后，将样品以14，000×g离心10分钟，并将上清液收集在单独的收集管中并储存在-80°C。
肽制备和 LC-MS/MS 分析
为了从蛋白质裂解物中去除SDS，按照Wisniewski等人的描述进行了过滤辅助样品制备（FASP）方法。将600微升蛋白质裂解物与8μL新鲜制备的UA溶液[0M尿素，1.8M Tris/HCl pH 5.0]混合，转移到Microcon离心过滤单元（MRCF030R14，默克密理博，达姆施塔特，德国）中，并在室温（RT）下以15，000×g离心200分钟。
然后，将过滤单元用14μLUA溶液以15，000×g洗涤两次100分钟以除去剩余的SDS。在黑暗中0分钟的孵育步骤中，用05μLIAA溶液（UA中的30.14M碘乙酰胺）实现硫醇的氨基甲酰甲基化。通过在室温下以15，000×g离心100分钟并用100μL UA溶液进行三次后续洗涤步骤来消除残留的IAA。用 0 μL ABC 缓冲液（H 中的 05.4 M NH3HCO<>2O），在室温下以14，000×g每次15分钟，将蛋白质用含有胰蛋白酶（胰蛋白酶与蛋白质比为40：1）的100μLABC缓冲液在37°C的湿室中消化约18小时。通过以14，000×g离心15分钟除去ABC-胰蛋白酶混合物后，加入50μL的0.5M NaCl，通过在室温下以14，000×g离心15分钟从离心过滤单元中洗脱肽。将得到的肽用CF3COOH（三氟乙酸，TFA;最终浓度 1%），并用 pH 纸（pH < 2）测试其酸度。在将肽应用于MS系统之前，使用“载物台吸头技术”和自制的C18滤头对消化的肽进行清洁、脱盐和浓缩。
洗脱后，将肽真空干燥，重悬于20 μL 0.1%甲酸（缓冲液A）中，并使用Pierce™定量比色肽测定试剂盒测定肽的浓度。对于MS分析，将脱盐肽重悬于缓冲液A（0.1%（v/v）甲酸）中，并在内径为50 mm的75 cm反相柱上分离，内部填充1.8 mm ReproSil-Pur 120 C18-AQ颗粒，使用180–2%缓冲液B（95.0%（v/v）甲酸， 1% （v/v） 乙腈），流速为 80 nL/min。在m/z = 250时，测量扫描的分辨率为60，000。选择电荷为>200的前15个丰度最高的前体进行碎裂。MS/MS 扫描的分辨率为 2，15，m/z = 000。所有其他参数都可以从 ProteomExchange 存储库中可用的原始文件中获取。
数据处理和统计分析
LC-MS/MS数据的处理使用MaxQuant软件（v1.6.3.3）进行。
对LFQ强度进行log2转化，过滤蛋白质组以消除污染物，逆转命中和仅按位点鉴定的蛋白质。保留至少70%的样品中鉴定出的蛋白质组以供进一步处理。与正常精子男性（N）相比，使用不等方差t检验来称呼低生育力男性（AN）及其各自的亚组（OA和A）中具有显着富集的蛋白质，并使用Benjamini-Hochberg程序对p值进行了多次测试，并确定各自样品比较的平均LFQ强度的倍数变化。Spearman的LFQ强度与所选精液参数（精子计数和渐进性精子活力）之间的相关性是使用R包Hmisc（v4.7-2）生成的。所有蛋白质的相关系数见表S3。为了进行ROC和logistic回归分析，将缺失值替换为以MS仪器检测限为中心的正态分布值，相对于每个样品所有蛋白质强度的标准差和平均值，宽度为0.3，降档为1.8。ROC 和逻辑回归分析使用 R 包 pROC （v1.16.0）、glmnet （v2.0_18）、插入符号 （v6.0_86）、扫帚 （v0.5.6） 和矩阵 （v1.2_18） 进行。为了增加单一蛋白质作为生物标志物的预测潜力，建立了结合2或3种蛋白质的统计模型。使用L1正则化的二元logistic回归分类模型的特征选择来减少测试的蛋白质数量并获得最佳生物标志物组合（LASSO 方法）。L1 正则化降低了模型特征的系数，使得某些特征的系数为 0，从而导致特征选择。数据被分成每个比较类的训练集（80%）和测试集（20%）。模型拟合到训练集，并根据测试集评估模型的性能。在每个比较组选择特征后，从蛋白质亚群中选择大小为2和3的组合，并将逻辑回归模型拟合到每个组合中。使用三重交叉验证来计算每个模型的ROC的AUC，以确定产生最高值的蛋白质组合。
结论
与正常精子型男性相比，生育力低下患者的基本精液特征分析了来自正常精子（n = 31）和低生育力男性（n = 22）的精子样本，包括9名少精子和13名弱精子男性（表1）。与低生育力男性（即少精子症和弱精子症）相比，正常精子型男性在精子数量和渐进性运动方面存在显着差异。与正常精子型男性相比，寡精子型和弱精子型男性在组合精子数量和活力以及精子数量、活力和形态方面存在显着差异（表1）。其他参数，包括年龄和体积，在这些比较中没有显着差异。
表 1.低生育力男性与正常精子男性对照（AN与N），少精子男性与正常精子男性对照（OA与N），弱精子男性与正常精子男性对照（A与N）的基本精液特征
低生育力和正常精子男性之间的蛋白质失调
区分了仅在单个，几个或所有上述比较中失调的蛋白质。将这些分析限制在多次测试调整后差异丰度的蛋白质（调整后的p值<0.05）。如图2所示，UCHL1蛋白是唯一在所有比较中都显示出较低丰度水平的蛋白质。HDDC2蛋白在两者中都显示出较低的丰度水平，OA与N的特定比较以及AN与N的一般比较中更多的蛋白质，即55种蛋白质在两者中具有不同的丰度，特定的比较A与N和一般比较AN与N，包括22个低丰度和33个高丰度的蛋白质。同样，仅在比较A与N中发现了更多数量的蛋白质（n = 125），包括72种较低丰度和53种较高丰度的蛋白质.在比较OA与N（n = 7）中仅发现很少的蛋白质，包括六种低丰度蛋白质（CFAP20，GLB1L，ACADM，ACOT7，TRAP1，RUVBL1）和一种丰度较高的蛋白质（SRP72）。在AN与N的一般比较中，共有八种蛋白质，包括STOM，PPP3CC，FHL1，TEX101，PRKACG，TSPAN16，RPS27A和CCT7，丰度水平较低，CANX是唯一在AN与N的比较中发现丰度水平较高的蛋白质。
图2.（A）韦恩图和（B）蛋白质的条形图，在低生育力男性与正常精子对照（AN与N），寡精子男性与正常精子对照（OA与N）的比较中显示出显着不同的丰度水平（调整后的p值<0.05），以及弱精子男性与正常精子对照（A与N）。
讨论
本实验报告了与正常精子对照相比，从弱精子和寡精子男性收集的人类精子的蛋白质组学情况。鉴定了许多蛋白质，这些蛋白质在低生育力和正常精子男性之间，在弱精子和正常精子男性之间，以及在少精子和正常精子男性之间具有差异的丰度水平。此外，发现许多蛋白质与精子活力和精子数量相关。其中一些蛋白质参与精子脂质组成和重塑、细胞外基质、糖萼、睫状运动和/或能量代谢。还有几种已知参与精子特殊功能的蛋白质，如精子获能和受精。我们确定了对一般不孕症和弱精子症与少精子症的潜在诊断价值的蛋白质组合。除了它们的诊断潜力外，这些蛋白质可能为我们提供新治疗靶点。